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剩余污泥（ES）是污水生物處理過(guò)程中的重要副產(chǎn)物，若處置不當(dāng)會(huì)影響生態(tài)環(huán)境。厭氧消化被認(rèn)為是重要的污泥處理方式，其可有效實(shí)現(xiàn)污泥減量化、資源化和無(wú)害化。氫氣是厭氧發(fā)酵過(guò)程的重要價(jià)值產(chǎn)物，其被認(rèn)為是化石燃料最有價(jià)值的替代品，因?yàn)樗哂懈吣芰棵芏龋?86kg/mol）和零燃燒排放。然而，水解過(guò)程緩慢及產(chǎn)生的氫氣極易被消耗成為污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫效率低的瓶頸問(wèn)題。近年來(lái)，如何提高污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫備受關(guān)注。

礦化垃圾（AR）是垃圾填埋過(guò)程產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其富含腐殖質(zhì)、水解酶且微生物群落結(jié)構(gòu)豐富。AR已被應(yīng)用到滲濾液處理、餐廚垃圾處理、土壤石油污染修復(fù)等領(lǐng)域。謝明德等采用16SrRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)證實(shí)了礦化垃圾層內(nèi)點(diǎn)位的微生物豐富度相近，但多樣性差別較大，厚壁菌門(mén)占比較高。此外，礦化垃圾表面含有大量官能團(tuán)及良好的孔隙結(jié)構(gòu)，其對(duì)污染物具有良好的吸附性能。Zhao等應(yīng)用AR促進(jìn)了ES厭氧水解酸化過(guò)程，并證實(shí)了AR內(nèi)水解酶具有重要作用。然而到目前為止，AR對(duì)ES暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，且在AR影響下污泥發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律也不清晰。為此，筆者以AR和ES為研究對(duì)象，在批式反應(yīng)器內(nèi)探究了AR對(duì)污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響及相關(guān)機(jī)制。首先，分析了AR含量對(duì)污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫性能的影響；然后，通過(guò)分析不同組別內(nèi)溶解性有機(jī)物的釋放、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度的變化、關(guān)鍵酶活性及微生物群落特征的變化規(guī)律揭示AR強(qiáng)化污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫機(jī)制。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用污泥為上海某城鎮(zhèn)污水處理廠初沉池和二沉池混合后的污泥，ES經(jīng)過(guò)濾去掉雜質(zhì)后靜置48h，去掉上清液。污泥特性：pH為6.8±0.2，總懸浮固體（TSS）為（15.6±0.2）g/L，揮發(fā)性懸浮固體（VSS）為（12.1±0.1）g/L，溶解性COD為（152±6.5）mg/L，VFA為（51±2.3）mg/L。

接種污泥取自上海某高校長(zhǎng)期運(yùn)行的厭氧反應(yīng)器，該反應(yīng)器在中溫（35℃）條件下連續(xù)運(yùn)行半年，污泥停留時(shí)間為20d。該反應(yīng)器主要用于厭氧處理城鎮(zhèn)有機(jī)固廢（污泥、廚余垃圾），氫氣產(chǎn)量約為10.2mL/gVSS。接種污泥特性：pH為7.1±0.1，TSS為（18.2±2.5）g/L，VSS為（16.5±1.6）g/L，溶解性COD為（245±12）mg/L，VFA為（135±8）mg/L。

AR取自上海某垃圾填埋場(chǎng)封存區(qū)填埋齡為10年的垃圾。取回后的AR經(jīng)篩分去掉大顆粒雜質(zhì)后用粉碎機(jī)粉碎至粉末狀備用。AR特性：pH為7.2，TSS為34.2g/L，腐殖質(zhì)為13.2g/L，Cu為0.04mg/g，Ni為0.05mg/g，Zn為3.2mg/g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)在有效體積為2.0L的厭氧反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行。首先向各反應(yīng)器內(nèi)接種1.0L的接種污泥和0.5L的ES。接種污泥在使用前先進(jìn)行120℃加熱10min預(yù)處理過(guò)程，以抑制產(chǎn)甲烷菌活性。然后向各反應(yīng)器內(nèi)投加AR，使AR初始含量分別為0（空白組）、3%、6%、9%和12%（以污泥TSS質(zhì)量計(jì)）。待物料投加完畢后，向各反應(yīng)器充入高純氮?dú)?0s，保證嚴(yán)格厭氧環(huán)境。隨后用橡膠塞密封各反應(yīng)器，再轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩箱進(jìn)行暗發(fā)酵。發(fā)酵溫度控制在（35±2）℃。待各組別氫氣累計(jì)產(chǎn)量增加不明顯時(shí)，取污泥樣品進(jìn)行微生物高通量測(cè)序。

1.3 分析方法

TSS、VSS和COD參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第4版）測(cè)定；多糖和蛋白質(zhì)分別采用苯酚-硫酸法和BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定；VFA采用帶有火焰離子化檢測(cè)器（FID）的氣相色譜儀分析；蛋白酶、淀粉酶、磷酸轉(zhuǎn)移乙酰酶（PTA）及輔酶F420的活性測(cè)定方法參照文獻(xiàn)；使用IlluminaHiSeq平臺(tái)通過(guò)16SrRNA基因測(cè)序比較不同AR暴露組別內(nèi)微生物的群落特征，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)。

2、結(jié)果與討論

2.1 AR對(duì)污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫氣的影響

AR對(duì)污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫氣的影響如圖1所示。在0~6d，各組的氫氣產(chǎn)量均急劇升高。穩(wěn)定階段空白組的氫氣產(chǎn)量為12.5mL/g，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道大致相似。AR的存在促進(jìn)了污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫，且影響程度與AR含量密切相關(guān)。當(dāng)AR含量由3%提高至9%時(shí)，氫氣產(chǎn)量由13.5mL/g提高至15.6mL/g。然而進(jìn)一步提高AR含量至12%時(shí)，氫氣產(chǎn)量卻下降至10.6mL/g，低于空白組。高含量AR降低了氫氣產(chǎn)量的原因可能是AR內(nèi)含有的重金屬等抑制了產(chǎn)氫微生物活性，降低了有機(jī)物向氫氣的生物轉(zhuǎn)化。此外，AR內(nèi)幾乎不含有機(jī)物，因此AR自身降解對(duì)產(chǎn)生氫氣的貢獻(xiàn)可以忽略。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，AR對(duì)污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫具有促進(jìn)作用，當(dāng)AR含量為9%時(shí)，氫氣最大產(chǎn)量為15.6mL/g，約為空白組的1.25倍。

2.2 AR對(duì)污泥水解過(guò)程的影響

水解是污泥暗發(fā)酵產(chǎn)氫的限速步驟，ES內(nèi)有機(jī)物主要以顆粒態(tài)或非溶解態(tài)存在，而污泥暗發(fā)酵過(guò)程中微生物更易吸收或轉(zhuǎn)化溶解態(tài)有機(jī)質(zhì)。圖2為AR對(duì)污泥暗發(fā)酵過(guò)程中SCOD濃度的影響。

由圖2可知，SCOD含量隨發(fā)酵時(shí)間呈先升高后平穩(wěn)波動(dòng)的變化趨勢(shì)?？瞻捉MSCOD含量在5d內(nèi)升至2451mg/L。當(dāng)存在AR時(shí)，SCOD含量急劇升高，且升高程度與AR含量有關(guān)。當(dāng)AR含量為3%時(shí)，SCOD濃度升高至3645mg/L，繼續(xù)提高AR含量至9%，SCOD濃度升高至4265mg/L，說(shuō)明AR提高了污泥暗發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)物的溶出量，從而為產(chǎn)氫微生物提供了充足的物質(zhì)保障。有研究證實(shí)，AR含有的水解酶和腐殖質(zhì)促進(jìn)了污泥內(nèi)顆粒狀有機(jī)物的生物轉(zhuǎn)化，從而提高了SCOD濃度。但當(dāng)AR含量提高至12%時(shí)，SCOD最大濃度為4156mg/L，低于AR含量為9%的，但仍高于空白組。高劑量AR含有的重金屬如Cu、Cd、Ni等會(huì)對(duì)水解酶活性產(chǎn)生抑制，進(jìn)而降低有機(jī)物溶出量。AR含有的重金屬一方面可作為微量元素強(qiáng)化厭氧發(fā)酵，另一方面過(guò)量的重金屬對(duì)污泥厭氧消化過(guò)程中有機(jī)物的生物利用、微生物代謝活性、關(guān)鍵酶活性的表達(dá)均具有抑制作用。此外，過(guò)量投加AR會(huì)導(dǎo)致重金屬在沼渣中殘留，在后續(xù)沼渣處理中可能引發(fā)環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。因此，在應(yīng)用AR強(qiáng)化ES資源化利用時(shí)需考慮投量，避免過(guò)度使用給污泥處理與處置帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。

AR對(duì)污泥暗發(fā)酵過(guò)程中溶解性蛋白質(zhì)和多糖濃度的影響如圖3所示。

由圖3可知，AR同樣提高了污泥中溶解性蛋白質(zhì)和多糖的濃度。當(dāng)AR含量為9%時(shí)，溶解性蛋白質(zhì)和多糖的最大濃度分別為2903和1195mg/L，顯著高于空白組的1054和694mg/L。當(dāng)AR含量為12%時(shí)，溶解性蛋白質(zhì)和多糖的最大含量分別為2150和945mg/L，高于空白組但是低于AR含量為6%的結(jié)果。AR含有能降解難生物降解物質(zhì)的水解酶，進(jìn)而促進(jìn)了蛋白質(zhì)和多糖物質(zhì)的溶解。可利用溶解性有機(jī)物的增加為產(chǎn)氫細(xì)菌提供了充足的基質(zhì)，從而提高了氫氣產(chǎn)量。

2.3 AR對(duì)污泥暗發(fā)酵液的影響

AR對(duì)污泥暗發(fā)酵過(guò)程中VFA濃度的影響如圖4所示。

由圖4可知，在空白組和低AR含量組中，VFA濃度均隨發(fā)酵時(shí)間先升高后趨于穩(wěn)定，而當(dāng)AR暴露劑量超過(guò)6%時(shí)，VFA濃度隨時(shí)間先升高后下降?？瞻捉MVFA的最大值為612mg/L；當(dāng)AR含量為3%時(shí)，VFA最大濃度提高至861mg/L；進(jìn)一步提高AR含量至9%時(shí)，VFA最大含量提高至1911mg/L。AR的存在使VFA濃度提高的原因可歸于以下3個(gè)方面：①AR促進(jìn)了暗發(fā)酵系統(tǒng)的水解過(guò)程，提高了發(fā)酵液中可利用有機(jī)物含量，為產(chǎn)酸微生物提供物質(zhì)保障；②AR含有大量腐殖質(zhì)（富里酸、胡敏酸等），研究證實(shí)腐殖質(zhì)的存在有利于促進(jìn)污泥酸化過(guò)程，從而提高了VFA積累量；③AR含有的腐殖酸、重金屬能抑制產(chǎn)甲烷菌的代謝活性，從而降低了VFA消耗。然而，當(dāng)AR含量升高至12%時(shí)，VFA卻下降至1036mg/L，但仍高于空白組。高含量AR降低VFA濃度的原因可能在于AR中含有的大量重金屬抑制了酸化微生物的代謝，并抑制了酸化過(guò)程酶活性的表達(dá)。VFA是酸化過(guò)程的重要產(chǎn)物，其含量在一定程度上表征了污泥暗發(fā)酵酸化程度。當(dāng)AR含量為9%時(shí)，VFA含量最大，表明適量的AR提高了污泥酸化程度。

AR對(duì)污泥暗發(fā)酵過(guò)程中VFA各組分占比的影響如圖5所示（以第5天為例）。乙酸鹽和丁酸鹽是VFA的主要組成部分，兩者占比之和高達(dá)53.8%~63.5%。AR的存在能影響VFA的構(gòu)成。第5天時(shí)，空白組的乙酸鹽和丁酸鹽占比分別為32.5%和21.3%；當(dāng)AR為6%時(shí)，乙酸鹽占比提高至35.6%，丁酸鹽占比略下降至20.3%。當(dāng)AR含量為12%時(shí)，乙酸鹽占比提高至40.6%，丁酸鹽占比為22.9%?？梢?jiàn)，適當(dāng)含量的AR提高了VFA中乙酸鹽占比，而略微降低了丁酸鹽占比；但高含量AR導(dǎo)致污泥暗發(fā)酵過(guò)程中VFA內(nèi)乙酸鹽和丁酸鹽占比均升高。乙酸鹽占比增加表明酸化過(guò)程被加速，說(shuō)明AR的存在提高了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸過(guò)程，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸過(guò)程的強(qiáng)化在一定程度上能提高氫氣產(chǎn)量，這也是AR含量為9%組別內(nèi)氫氣產(chǎn)量最高的原因之一。

2.4 AR對(duì)暗發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵酶活性的影響

ES暗發(fā)酵產(chǎn)氫氣過(guò)程需要多種關(guān)鍵酶，其中蛋白酶和淀粉酶與污泥內(nèi)蛋白質(zhì)和多糖的生物降解密切相關(guān)，PTA與乙酸鹽的生物合成密切相關(guān)，產(chǎn)甲烷過(guò)程需要輔酶F420。AR對(duì)污泥暗發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵酶活性的影響如圖6所示?？芍?，AR的存在提高了與生物產(chǎn)氫相關(guān)關(guān)鍵酶的活性。當(dāng)AR含量為9%時(shí)，蛋白酶、淀粉酶和PTA的相對(duì)活性分別提高至124.6%、118.5%和107.5%，說(shuō)明適量AR的存在提高了水解酸化過(guò)程，這與圖2結(jié)果一致。當(dāng)AR含量為12%時(shí)，蛋白酶和淀粉酶的相對(duì)活性分別為118.5%和113.4%，低于AR含量為9%的，但PTA相對(duì)活性為108.7%，略高于AR含量為9%的。至于輔酶F420活性，AR的存在降低了F420活性，且AR含量越高，對(duì)F420活性的抑制越顯著。尤其當(dāng)AR含量為12%時(shí)，F(xiàn)420的相對(duì)活性下降至64.5%，說(shuō)明AR降低了產(chǎn)甲烷菌的活性，減少了氫氣的消耗。AR含量為9%和12%的F420相對(duì)活性差異不顯著，但AR含量為9%時(shí)水解過(guò)程被顯著加速，這也導(dǎo)致其氫氣產(chǎn)量最大。

2.5 AR對(duì)暗發(fā)酵過(guò)程中微生物群落特征的影響

AR對(duì)污泥暗發(fā)酵過(guò)程中微生物群落在門(mén)水平上的影響見(jiàn)圖7?？梢钥闯?，F(xiàn)irmicutes、Bacteroidota、Proteobacteria和Chloroflex是主要的門(mén)水平微生物，約占48.5%~60.7%。AR的存在影響了微生物群落結(jié)構(gòu)。尤其當(dāng)AR含量由0提高至6%時(shí)，F(xiàn)irmicutes的相對(duì)豐度由18.6%增長(zhǎng)至23.6%；當(dāng)AR含量提高至9%時(shí)，Proteobacteria的相對(duì)豐度由12.3%提高至17.6%。有研究證實(shí)，F(xiàn)irmicutes是水解過(guò)程中主要的菌群，而Proteobacteria、Bacteroidota和Firmicutes是酸化過(guò)程的主要菌群。Firmicutes對(duì)有機(jī)物的水解酸化具有重要作用。AR內(nèi)水解酶促進(jìn)了有機(jī)物的水解，提高了污泥暗發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)負(fù)責(zé)水解酸化過(guò)程微生物的相對(duì)豐度，進(jìn)而提高了氫氣產(chǎn)量。

AR對(duì)污泥暗發(fā)酵過(guò)程中微生物群落在屬水平上的影響如圖8所示。

由圖8可知，AR同樣顯著影響了微生物在屬水平上的分布。Bacteroides是一種水解微生物，能促進(jìn)海藻酸鹽、槐脂等大分子多糖的水解。AR的存在提高了Bacteroides的相對(duì)豐度，尤其當(dāng)AR含量為9%時(shí)，其相對(duì)豐度提高至4.1%，顯著高于空白組的3.2%。此外，Gallicola在各組別中的占比均超過(guò)2.0%，且AR的存在進(jìn)一步提高了其相對(duì)豐度。當(dāng)AR含量提高至9%時(shí)，Gallicola的相對(duì)豐度提高至2.6%，高于空白組的2.1%。Gallicola是與產(chǎn)氫密切相關(guān)的微生物，其相對(duì)豐度的增加提高了氫氣產(chǎn)量?？梢?jiàn)，AR提高了與水解酸化過(guò)程相關(guān)的關(guān)鍵微生物的相對(duì)豐度，進(jìn)而提高了氫氣產(chǎn)量。

3、結(jié)論

AR提高了污泥發(fā)酵系統(tǒng)的氫氣產(chǎn)量，當(dāng)AR含量為9%時(shí)，氫氣最大產(chǎn)量為15.6mL/g，約為空白組的1.25倍。AR促進(jìn)了污泥暗發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)水解酸化過(guò)程，提高了溶解性有機(jī)物的釋放量。當(dāng)AR含量為9%時(shí)，溶解性COD、溶解性蛋白質(zhì)和多糖含量分別為4265、2903和1195mg/L，均顯著高于空白組。AR可提高與水解酸化過(guò)程相關(guān)關(guān)鏈酶的活性。在門(mén)水平上，AR提高了Firmicutes和Proteobacteria的相對(duì)豐度；在屬水平上，提高了Bacteroides和Gallicola的相對(duì)豐度。